Acquisto di sistema di microscopia confocale ad alta risoluzione STED e FLIM

Description

La sede di Padova dell’Istituto di Neuroscienze (CNR-IN-PD) intende procedere all’acquisto di un microscopio confocale in grado di offrire, in aggiunta alle comuni applicazioni di microscopia confocale, la possibilità di acquisire immagini da campioni contenenti diversi fluorofori (almeno 5, preferibilmente 8), anche in super-risoluzione e con misura del tempo di decadimento (lifetime) dei fluorofori Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), sia in campioni fissati che vivi. L’acquisto si rende necessario nell’ottica di potenziare il nodo italiano di Advanced light microscopy dell’infrastruttura di ricerca europea Euro-BioImaging, di cui IN-PD fa parte, nei modi indicati nel progetto finanziato “StrEngthEning the ItaLIan InFrastructure of Eurobioimaging – SEE LIFE” (IR0000023 - cod.24C660A8 - PNRR - NextGenerationEU - Missione 4 - Componente 2 - Linea di investimento 3.1). Lot 1: Il progetto finanziato prevede l’acquisizione di un microscopio confocale che rappresenti lo stato dell’arte della microscopia confocale avanzata, coniugata a super-risoluzione STED e Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Il gruppo di ricerca è specializzato nell’impiego della tecnica FRET per lo sviluppo di biosensori e lo studio delle interazioni (intra- o inter-molecolari) tra proteine. Tale tecnica, che permette di valutare l’interazione tra molecole quando queste sono a una distanza < 10 nm (ossia con un’elevata specificità), viene tipicamente usata in modalità intensiometrica, vale a dire valutando i cambiamenti reciproci di intensità di fluorescenza delle molecole “donatore” e “accettore”. Questo approccio soffre tuttavia di possibili problematiche, come lo sbilanciamento dei livelli di espressione tra donatore e accettore e la necessità di illuminare il donatore con una quantità elevata di fotoni (andando incontro a possibili fenomeni di photobleaching e fototossicità). Per evitare le problematiche legate all’approccio intensiometrico, il gruppo di ricerca ha individuato come soluzione l’abbinamento FLIM-FRET. Grazie a questa tecnologia, il readout del segnale FRET dipende solo dai cambiamenti nel lifetime del donatore, garantendo pertanto di illuminare il campione in modo molto più delicato e minimizzando la fototossicità. L’impiego della tecnica FLIM-FRET con normali microscopi a fluorescenza o confocali non permette di localizzare con elevata precisione spaziale dove queste interazioni avvengono, a causa del limite di risoluzione spaziale di questi sistemi. Per questo motivo, è intenzione del gruppo dotarsi di un sistema in grado di effettuare misure FLIM-FRET in super-risoluzione. Tra le tecniche di super-risoluzione attualmente disponibili, il gruppo di ricerca ha scelto la tecnica STED (STimulated Emission Depletion), in quanto più adatta ad imaging di cellule vive. Di fondamentale importanza per le attività sperimentali del gruppo di ricerca è la possibilità di acquisire immagini (applicando al bisogno FLIM, STED, FRET e combinazioni di questi) da campioni contenenti diversi fluorofori, e la possibilità di selezionare liberamente le lunghezze d’onda di eccitazione nello spettro del visibile (idealmente all’interno del range 440 – 790 nm) e il range di emissione. Questo ultimo punto è particolarmente rilevante in quanto una delle attività principali del gruppo di ricerca è la realizzazione di nuove sonde molecolari fluorescenti per la misura di diversi parametri cellulari. Le sonde di nuova generazione presentano proprietà di fluorescenza che si possono discostare dai classici fluorofori, richiedendo pertanto flessibilità nelle linee di eccitazione e nei range di emissione. Per questi motivi riteniamo che il sistema Leica Stellaris 8 TauSTED sia l’unico sistema di microscopia confocale presente sul mercato che permetta di effettuare imaging ad alta risoluzione spaziale (grazie all’abbinamento FLIM-STED) e temporale, su fluorofori multipli e con spettri di eccitazione/emissione non convenzionali (grazie alla sorgente di eccitazione regolabile e la possibilità di selezionare liberamente il range di emissione, in combinazione con FLIM) applicabile su campioni sia fissati che vivi (grazie alla ridotta fototossicità garantita dal sistema).